载体构建

载体构建

基因表达载体构建是指目的基因与运载体结合。基因表达载体构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。基因表达载体构建的意义是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

标签蛋白纯化的优势

一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝，为了研究某一个蛋白质，必须先将目的蛋白质从其他细胞组分中分离提纯出来，如果打算将目的蛋白应用于下游实验，那么成功表达重组蛋白是很重要的。

倘若在试验开始时花点时间做好蛋白优化，将会大大增加后续试验的可行性。

蛋白纯化这一过程通常从细胞裂解开始（对于分泌性蛋白质的提纯则不需要裂解细胞），通过破坏细胞膜将细胞内含物释放到溶液中，从而获得含有目的蛋白质的细胞裂解液，然后通过超速离心将细胞裂解液中膜脂和膜蛋白、细胞器、核酸以及含有可溶蛋白质的混合物。

目前我国的一些医药研发外包服务公司，例如美迪西生物医药提供的就有蛋白纯化这一服务项目。

首先我们来了解一下蛋白纯化的基本步骤：一、蛋白纯化的步骤：1、首先是材料的预处理及细胞破碎。

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。

所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。

常用的破碎组织细胞的方法有：（1）利用机械力的剪切作用，使细胞破碎的机械破碎法，常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

（2）在低渗条件使细胞溶胀而破碎的渗透破碎法。

（3）使生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破的反复冻融法。

这种方法相对来说比较简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

（4）使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎的超声波法。

（5）用溶菌酶破坏微生物细胞的酶法等等。

2、蛋白质的抽提，通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。

抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。

如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。

在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

3、蛋白质粗制品的获得。

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来，比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

常用的有下列几种方法：（1）等电点沉淀法：不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

（2）盐析法：不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。

被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

（3）有机溶剂沉淀法：中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低，能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。

此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。

由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

4、样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。

常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等，有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。

其中蛋白质亲和层析法通常只需要一步操作便能将目标蛋白从混合物中分离出来，且纯度很高，因而备受实验者的喜爱。

在进行重组蛋白表达时，选择合适的标签有利于蛋白的纯化，促进蛋白的可溶性，因此了解几种常用的蛋白纯化标签很重要。

二、常用的蛋白纯化标签1、His标签His tag（组氨酸标签）融合蛋白是目前最常见的表达方式，其优点是标签小，纯化步骤简便，纯化条件温和，能纯化可溶性/包涵体蛋白，一般不会影响蛋白的功能结构，且可以产出大量的目标蛋白，但该标签不适合易氧化蛋白或膜蛋白的纯化。

2、GST标签GST tag（谷胱甘肽巯基转移酶）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化。

它的优点是洗脱条件温和，有助于保持蛋白功能活性，适合pull-down 检测，具有很好的线性动态范围，缺点是分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验，如果蛋白不可溶，很难用变性的方法进行纯化。

3、MBP标签MBP tag（麦芽糖结合蛋白标签）可以减少目标蛋白的降解，增加蛋白的表达量和稳定性，提高表达产物的水溶性，但标签较大，对蛋白的结构和功能会有一定影响。

4、NusA标签NusA tag（转录终止/抗终止蛋白标签）不具有独立的纯化标签功能，需要和其他标签（如His标签）联用，可提高蛋白质的溶解性，但由于分子量较大，对蛋白下游应用会有影响。

5、Strep标签Strep tag（strep标签）能产出高纯度（95%）的目标蛋白，且能保持目标蛋白活性，主要是因其纯化流程温和。

其次，能进行变性条件下的纯化，在用于WB/ELISA，可侦测目标蛋白；另外，还可固定目标蛋白，检测蛋白质交互作用，或更进一步用以筛选治疗用蛋白质，或是工业用酵素。

但Strep tag纯化系统的价格相对His tag而言较高，所产出的目标蛋白数相对较少。

6、Flag标签Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有Flag的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

Flag作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。

通过Flag进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高；Flag作为标签蛋白，其可以被抗Flag的抗体识别；融合在N端的Flag，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。

因此现Flag标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

三、蛋白纯化的3种新标签上述的常用的蛋白纯白标签His标签、GST标签、MBP标签等，尽管这些标签系统各具特色，但它们也分别存在着一些缺陷，还无法完全满足研究者们的需求。

为此，Biotechniques杂志盘点了近期出现的三种新蛋白标签系统，以便为研究者们提供更大的选择空间。

这三种蛋白便签系统分别利用了高亲和力单抗、无机矿物基质以及能够剪切标签的金属离子。

1、单克隆抗体标签日本研究者Yukinari Kato在开发胶质母细胞瘤的治疗性抗体时，无意中发现了一个可用作亲和标签的肽段。

Podoplanin蛋白是一个在恶性癌细胞中高度表达的跨膜蛋白，Kato生成的大鼠单克隆抗体NZ-1可以靶向该蛋白中一个14个残基的肽段。

他们发现NZ-1与Podoplanin蛋白的亲和力特别高，可以将其开发成为一个蛋白标签系统。

研究人员将与NZ-1结合的Podoplanin肽段称为PA标签，并将其与现有的其他标签系统进行比较，发现NZ-1和PA标签之间的亲和力更高，解离更慢。

目前他现在正努力将这一标签系统应用到蛋白质组分析中去，希望能够用其替代FLAG标签。

2、磷灰石基质人们常常用固化的抗体和金属离子来纯化重组蛋白，不过这些方案并不完美，存在着金属离子析出、稳定性低和成本高等问题。

为此，Jacobs大学的Marcelo Fernandez-Lahore用无机矿物氟磷灰石，开发了一个新的亲和标签纯化系统。

以磷酸钙为基础的磷灰石（例如羟磷灰石和氟磷灰石），几十年来，一直被用作生物分子的吸附剂，其优势在于这种物质既没有抗原性也没有细胞毒性。

然而，人们一直未能将它们用于层析法蛋白纯化。

因为此前的磷灰石基质“颗粒形状不规则，且在某些条件下很容易溶。

Fernandez-Lahore实验室在这种材料的基础上，开始寻找与氟磷灰石高度亲和的标签肽段。

研究人员通过噬菌体展示筛选，发现肽段KPRSVSG与CFT的结合能力很强，于是他们决定将这个CFT结合肽段（CBP）开发成为蛋白纯化的亲和标签。

3、二合一系统尽管许多蛋白与亲和标签融合后也能够正常工作，但不少实验还是要求去除这些标签。

人们往往将剪切位点设计在蛋白标签旁边，以便用蛋白酶消化时能够将其切下来。

为了进一步简化这一过程，哥本哈根大学的Niels ErikMøllegaard提出了一个有趣的新标签系统。

在该系统中，一个分子可以同时实现亲和结合和蛋白标签的剪切，这个分子就是二价铀酰离子（UO22+）。

四年前研究团队发现，铀酰可以在蛋白中对磷酸化的丝氨酸进行光切割。

研究人员随即想到，可以合成一个包含特异性磷酸化位点的标签，使其与固化的铀酰离子结合，该系统可以在光切割后释放出纯化的无标签重组蛋白。

美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面有10余年经验积累，美迪西生物医药拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术。